Молекулярно-биологические исследования

Для студентов, аспирантов и сотрудников РАН - скидки!

Для установления таксономической принадлежности стерильных стадий развития субстратного мицелия и сформировавшихся плодовых тел дереворазрушающих грибов нами успешно апробирована методика молекулярной диагностики грибных фитопатогенов на основе анализа нуклеотидных последовательностей рДНК (ITS-регион и ген 5.8S-субъединицы рибосомы). Эта область, отличающаяся пластичностью у различных групп грибов, наиболее подходит для идентификации видов. Экстракция ДНК из высушенных плодовых тел и субстратного мицелия проводится с использованием универсальных наборов реактивов для молекулярных исследований, ПЦР-амплификация рибосомального участка ITS1-5.8S-ITS2 осуществляется с использованием "грибных" праймеров ITS1F и ITS4B. Предлагаемый методологический подход находит свое применение в сфере идентификации причин биологического разрушения деревянных конструкций и изделий. Ежегодный ущерб, наносимый дереворазрушающими грибами-макромицетами, оценивается значительным количеством денежных средств во всем мире, однако своевременное выявление и правильное определение грибных агентов биоповреждений еще на стерильных стадиях развития организма позволяет не только сократить масштабы данного вреда, но и предупреждать его повторное проявление.

Настоящие исследования особенно актуальны в условиях Санкт-Петербурга и ряда историко-архитектурных и природно-мемориальных комплексов, на территории которых сохранились объекты национального и всемирного культурного наследия. Результаты работы могут быть востребованы специалистами по ландшафтному дизайну и защите растений, сотрудниками муниципальных комитетов и профильных служб, отделов природы, государственных учреждений Министерства природных ресурсов и Министерства культуры Российской Федерации.

Помимо этого, применение методов молекулярной биологии позволяет решать и производственные задачи - например, нами было выполнено микологическое расследование заражения препарата иммуноглобулина на фармацевтическом производстве. Исследовали случай производственного заражения микроскопическими грибами препарата рекомбинантного человеческого иммуноглобулина в виде раствора для инъекций. Во флаконах присутствовали хлопьевидные фрагменты грибного мицелия. Исследование проводили методами световой микроскопии, посева, ДНК-анализа. Были идентифицированы 3 изолята: Cladosporium cladosporioides (обитатель растительных остатков и почвы), Fomitopsis pinicola (дереворазрушающий гриб), и сумчатый гриб из порядка Helotiales (сапротрофы и паразиты древесных растений). Попадание таких видов в фармацевтический препарат не могло быть результатом биозаражения производственной линии, а очевидно было вызвано внешней контаминацией. Таким образом, было установлено, что в помещения розлива стерильного препарата попадает уличный воздух. Проведенное на производстве внутреннее расследование позволило установить, что сотрудниками однократно были грубо нарушены правила асептики, в помещении розлива препарата было приоткрыто окно. Точная видовая идентификация грибных контаминантов позволила избежать простоя предприятия и установить причину проблемы.